Archives de l’Institut Pasteur de Tunis (2008) — Vol.85 (1-4) — https://doi.org/04pwyer06 — voir sur pist.tn
"Leishmania infantum (L.i) is responsible for visceral (VL) or cutaneous (CL) leishmaniasis. Previous studies done in Honduras by differential display reverse transcriptase-polymerase chain reaction (DDRT-PCR) failed to demonstrate differences in expression profiles among L. infantum VL and CL parasites. For purpose of comparing expression among L. infantum isolates in Tunisia, a variant of this technique adapted from a commercial kit was developed involving pairs of random and anchored mini-exon primers for isolation and identification of differentially displayed cDNAs. To assess the efficiency of this variant, 34 pairs were applied to 2 consecutive dilutions of cDNAs from promastigotes at end of in vitro exponential growth of 2 visceral (LV50) and cutaneous (DREP14) isolates from Tunisia, thus increasing chance for observing differences among the cDNAs. Profiles were compared and analyzed as regards number and phenotype of bands displayed in 4 types of highly similar amplification profiles among the 2 cDNAs; 26 primer pair combinations generated in total 6.8% differentially displayed bands that had variable intensities or were present/absent, in comparable proportions in the 2 isolates. Analysis further demonstrated differences in amplification efficiency of some primers, emphasizing on qualitative and quantitative impact of relative proximity of the priming sites. Nine present/absent bands were cloned, sequenced and analyzed in silico. Mismatches at priming sites seem to underlie amplification of such bands. Only five products could be referred to annotated gene. Among the genes identified, we list histone H4, largely known to be differentially expressed among L.i stages, and “NTF2-like” for which over-expression in one cDNA was here confirmed. To conclude, the variant developed could be used further in Leishmania expression analysis with appropriate cautions about false positives."
Keywords: A variant of DDRT-PCR using anchored mini-exon primers for identification of differentially expressed sequences in Leishmania infantum
Résumé :"Leishmania infantum (L.i.) est responsable de leish- maniose viscérale (LV) ou de leishmaniose cutanée (LC). Des études précédentes faites au Honduras n'ont pas montré de différences dans les profils d'expression de differential display reverse transcriptase-polymerase chain reaction (DDRT-PCR) entre les parasites LV et LC de Leishmania infantum. Dans le but de comparer l'expression entre des isolats de L.i. en Tunisie, une variante de cette technique adaptée d'un kit commercial a été déve- loppée impliquant des amorces aléatoires et mini- exon ancrées pour isoler et identifier des ADNc différentiellement affichés. Pour évaluer l'efficacité de cette variante, 34 combinaisons ont été appli- quées à 2 dilutions consécutives d'ADNc, qui proviennent de cultures de promastigotes en fin de phase exponentielle de croissance de deux isolats Tunisiens, un viscéral (LV50) et un cutané (DREP14). Le choix de ce matériel assure l’observation des différences parmi les ADNc étant donné les travaux précédents chez cette espèce. Les profils d’amplification ont été comparés et analysés relativement au nombre et au phénotype des bandes affichées obser- vées parmi les différents profils d'amplification qui ont été très similaires chez les 2 ADNc; 26 combinai- sons ont généré un total de 6.8% de bandes différentiellement affichées ayant des intensités varia- bles ou étant présentes/absentes, dans des proportions comparables dans les 2 isolats. Les analyses ont aussi démontré des différences dans l’efficacité de l’amplification de quelques amorces, soulignant l'impact qualitatif et quantitatif de la proximité relative des sites d’amorçages sur les profils observés. Neuf bandes présentes/absentes ont été clonées, séquencées et analysées in silico. Les misapparie- ments aux sites d’amorçage semblent être à la base de l'amplification de telles bandes. Seulement cinq produits ont pu être référés à des gènes annotés. Parmi les gènes identifiés, nous énumérons l'histone H4, en grande partie connue pour être différen- tiellement exprimée parmi les stades de L.i, et «NTF2-like» pour lequel une surexpression a été ici confirmée dans un des ADNc. Pour conclure, la variante développée pourrait être utilisée dans des analyses d'expression chez Leishmania, avec toute- fois une attention particulière au sujet des faux positifs."